【摘要】 目的： 對中華按蚊多態的微衛星DNA位點進行分離和篩選，並闡明其特徵. 方法： 應用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大，克隆並測序，構建中華按蚊微衛星DNA庫. 在其中挑選合適的微衛星位點，建立擴增體系. 應用中華按蚊現場樣本擴增不同的微衛星位點，聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態性的微衛星位點. 結果： 構建的中華按蚊微衛星DNA庫中包含252條序列，GenBank註冊登記號爲EF620047～EF620298. 其中，雙核苷酸重複最爲常見，三核苷酸重複次之，多核苷酸重複少見；含（CA）和（GT）重複的序列最多，重複次數最多可達56次；完整序列佔35.3%，非完整序列佔20.2%，複合序列佔18.7%，其餘爲非典型序列. 設計了22對引物擴增不同的微衛星位點，其中20個位點產生特異的PCR產物，PAGE結果顯示其中15個位點具有多態性. 結論： 獲得了中華按蚊新的多態微衛星位點共15個，爲中華按蚊羣體遺傳和其他相關研究提供了分子標誌.
【關鍵詞】 中華按蚊；微衛星DNA
0引言
微衛星DNA是一類簡單的短核苷酸串聯重複序列，又稱簡單重複序列，廣泛分佈於真核生物的基因組中，每間隔10～50 kb即存在一個微衛星DNA. 微衛星DNA包括核心序列和兩側的側翼序列，通常核心序列重複單元長1～6 bp，重複次數爲10～60次，其重複次數的差異導致微衛星DNA具豐富的長度多態性［1-2］. 微衛星DNA已經廣泛應用於研究生物多樣性、羣體遺傳結構、行爲生態和親緣關係等［3］，是一種理想的的分子標誌. 中華按蚊（Anopheles sinensis Wiedemann, 1828）在我國分佈廣且種羣數量大，是以往文獻記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介［4-5］. 本研究擬構建中華按蚊的微衛星DNA庫並篩選其中多態的微衛星位點，爲中華按蚊基因組學研究積累基礎資料，併爲其相關研究提供新的分子標誌.
1材料和方法
1.1材料構建中華按蚊微衛星DNA庫的樣本爲上海實驗室品系，由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所提供. 現場中華按蚊採自雲南思茅（2005?08，n=10）、雲南鹽津（2006?07，n=10）和湖北武漢（2006?07，n=10），選擇雌性成蟲爲實驗材料.
1.2方法
1.2.1微衛星DNA庫構建基因組DNA的抽提參照Hammond等的文獻進行［6］，-20℃保存待用. 基因組DNA經Sau3AI酶切，回收200～800 bp的片段，加SAUL接頭連接，接頭序列如下：SAULA?：GCGGTACCCGGGAAGCTTGG，SAULB?：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC. 以SAULA爲引物，連接產物作爲模板PCR擴增，反應液中含PCR緩衝液、2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.8 μmol/L引物，0.6 U Taq 酶（上海生工生物工程有限公司）和2 μL模板，在熱循環儀（PTC?100，美國ABI公司）上執行如下程序：72℃ 5 min後，94℃ 1 min，67℃ 1 min和72℃ 2 min共32個循環，72℃延伸5 min. 將擴增產物變性後，與Biotin?16?dd UTP（瑞士Roche公司）標記的寡核苷酸探針雜交，探針包括：(AAT)17，(GA)25，(CCT)17，(AC)25，(CAG)17，(CAC)5，(TC)10，(GT)8和(TG)18. 用親和素Vectrex Avidin D（英國Vector Labs公司）捕獲並超濾離心（美國Millipore公司）濃縮富集雜交的目的片段. 以富集的核酸作爲模板，SAULA爲引物擴增，反應體系和程序同前. 隨後，用PCR產物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴增. 將上述擴增產物插入TOPO?T載體（美國Invitrogene公司），轉化 JM109，挑選含微衛星DNA序列的陽性克隆，用四色熒光標記雙脫氧鏈終止法測序（PE?ABI3770全自動測序儀，上海英駿生物技術有限公司），應用BioEdit（Version 5.0.9）軟件包分析所獲序列.
1.2.2微衛星DNA多態位點篩選單蚊抽提現場中華按蚊基因組DNA，參照文獻進行分子鑑別確認蚊種爲中華按蚊［7］. 選擇22條重複次數較多，且典型的微衛星DNA序列，應用Primer 3（Version 3.1）軟件包設計引物. 以單蚊基因組DNA爲模板，PCR擴增微衛星DNA（反應體系和程序同前），退火溫度範圍在55℃～60℃. 擴增產物經5%聚丙烯酰胺凝膠電泳後，銀染、顯色，依據凝膠上的條帶判斷其是否具有多態性.
2結果
2.1中華按蚊微衛星DNA庫構建的中華按蚊微衛星DNA庫中包含282條序列，其中18條序列完全相同，21條序列較短（小於100 bp），故有效的微衛星DNA序列共252條，GenBank註冊號爲EF620047～EF620298. 分析所獲的微衛星DNA序列，顯示其長度範圍爲50～800 bp，大多數在300 bp左右. 就重複情形而言，雙核苷酸重複最爲常見，三核苷酸重複次之，多核苷酸重複少見；含（CA）和（GT）重複的序列最多，重複次數不等，最多可達56次. 所獲的微衛星DNA依據文獻［8］標準劃分，結果完整序列爲89條（35.3%），非完整序列51條（20.2%），複合序列47條（18.7%），其餘爲非典型序列（25.8%）.
2.2中華按蚊微衛星多態位點設計併合成了22對擴增微衛星DNA的`引物，對現場樣本進行擴增的結果顯示，20個位點有特異的PCR產物，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（一條帶爲純合子，兩條帶以上爲雜合子），共有15個微衛星DNA位點具有多態性（表1）. 本研究的多態微衛星位點在退火溫度爲55℃時，均存在特異產物. 表1中華按蚊多態的15個微衛星位點特徵
3討論
通過比較分析本研究所獲中華按蚊微衛星DNA序列的特點，發現與已報告的岡比亞按蚊（An. gambiae）［9-10］，催命按蚊（An. funestus）［11-12］和穆歇按蚊（An. moucheti）［13］等相似，均爲雙核苷酸重複最常見，三核苷酸重複次之，多核苷酸重複少見. 韓國學者Jung等［14］應用(GA)22和(CA)22寡核苷酸探針分離和篩選了韓國的中華按蚊微衛星DNA陽性克隆48個，與之比較，本研究應用了更多的探針，特別是三鹼基重複序列的探針，分離的我國中華按蚊微衛星DNA序列，不僅重複單元序列多樣化，而且序列的數量也較多，更具廣泛性，極大地豐富了中華按蚊的微衛星DNA序列數據庫.
