【摘要】 目的 研究血管性癡呆(VD)大鼠學習記憶障礙及發病機制。方法 4血管阻斷法制作模型，Morris水迷宮法檢測學習記憶能力，免疫組化法觀察Bcl?2和Bax表達，流式細胞術檢測海馬神經細胞凋亡率，亞甲藍比色法檢測血清中H2S含量。結果 模型組大鼠學習記憶能力明顯減退。Bcl?2/Bax在缺血再灌注(I/R)開始時升高，隨後開始下降。模型組大鼠海馬神經細胞凋亡率明顯增加。模型組大鼠血清中H2S含量明顯減少。血清H2S含量與海馬神經細胞凋亡率間呈明顯負相關。 結論 VD可導致學習記憶障礙，海馬神經細胞凋亡和血清中H2S含量減少;海馬神經細胞凋亡程度可能與內源性H2S生成減少有關。
【關鍵詞】 血管性癡呆;學習記憶;免疫組化;流式細胞術;硫化氫
血管性癡呆(VD)是老年期癡呆的主要類型之一，它是由一系列腦血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等)導致腦組織損害引起的以認知功能障礙爲特徵的癡呆綜合徵〔1〕，不僅給病人帶來長期痛苦，嚴重影響其生活質量，而且給家庭、社會造成沉重負擔，因此研究VD的發病機制以指導其防治具有很高的社會價值和現實意義。H2S是第三類氣體信號分子，廣泛參與機體的多種生理和病理過程，爲進一步瞭解其在VD發病中的作用，本研究觀察大腦缺血/再灌注(I/R)不同時間對大鼠學習記憶能力的影響、血清中H2S含量改變及海馬CA1區神經細胞凋亡情況，從行爲學、細胞凋亡及內源性H2S表達量及其相互關係等方面，探討VD的發病機制，爲其防治提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 動物與分組 健康Wistar雄性大鼠64只，體重300～350 g(由河北省實驗動物中心提供)，隨機分爲8組，正常組，假手術組和VD模型組，VD模型組又分爲大腦I/R 2，8，24，72，168和720 h組，每組8只動物。
1.2 動物模型製備 4血管阻斷法(4?VO法)〔2〕建立VD大鼠模型。假手術組麻醉及手術過程與VD模型組相同，但不電凝雙側椎動脈，不阻斷雙側頸總動脈。術後按再灌注的不同時間分別將動物處死,經主動脈依次灌注生理鹽水100 ml和4%多聚甲醛500 ml，取出腦組織，石蠟包埋切片，用於免疫組化顯示Bcl?2、Bax及蘇木素?伊紅(HE)染色。
1.3 學習記憶能力的測定 Morris水迷宮檢測〔3〕：實驗開始於VD術後4 w，預先將迷宮任意分爲4個象限。平臺放入上述4個象限中隨機選擇的1個象限中，在大鼠游泳池邊標記4點作爲大鼠的入水點，記錄120 s內大鼠從入水到爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期。記錄各組大鼠的逃避潛伏期，作爲學習記憶能力檢測指標。
1.4 取材 大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg體重)腹腔注射麻醉後，快速開胸暴露心臟，心尖取血4～5 ml，分離血清，用於血清H2S含量測定;然後斷頭處死，並立即在冰臺上開顱，迅速分離大鼠海馬，用70%酒精固定，4℃冰箱保存過夜，用於流式細胞術檢測。
1.5 HE染色 切片常規脫蠟至水→1%鹽酸酒精分化→伊紅染色2 min→切片常規梯度酒精脫水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性樹膠封固。
1.6 免疫組化染色(SP法) Bax兔抗鼠多克隆抗體，Bcl?2兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司生產)。
1.7 流式細胞術檢測 採用美國Beckman Coulter公司生產的Epics?XL Ⅱ型流式細胞儀。
1.8 血清中H2S含量的檢測 亞甲藍分光光度法。
1.9 統計學處理 用SPSS13.0統計軟件，採用單因素方差分析，兩兩比較採用SNK法。
2 結 果
2.1 學習記憶能力檢測結果 各組大鼠在迷宮各入水點搜索平臺的結果見表1，隨着訓練天數的增加，各組大鼠的逃避潛伏期均縮短，第2天I/R 720 h組與正常組和假手術組比較逃避潛伏期明顯延長(P<0.01);正常組和假手術組逃避潛伏期差異不顯著(P>0.05)。
2.2 VD大鼠病理形態學結果 HE染色後，神經細胞胞漿呈淡紅色，核呈藍黑色。假手術組大鼠海馬CA1區神經元排列整齊、密集，細胞完整，結構正常，胞漿豐富，膠質細胞無增生;細胞核呈圓形、橢圓形，無變性，無固縮或溶解現象。VD模型組海馬CA1區神經元排列紊亂，神經元變性，體積變小，胞核與胞漿界限不清，核固縮成三角形或不規則形，而且隨I/R時間的延長，變性神經元數目越多，見圖1。 表1 各組逃避潛伏期比較
2.3 凋亡蛋白表達結果
2.3.1 VD大鼠模型海馬CA1區Bcl?2表達 VD模型組I/R 2 h Bcl?2蛋白平均OD值開始明顯上調，I/R 8 h達到高峯，之後隨I/R時間的延長開始下降，但I/R 24 h組仍高於假手術組。假手術組與I/R不同時間點組間，Bcl?2的表達情況均有顯著差異(P<0.01)(表2)。
2.3.2 VD大鼠模型海馬CA1區Bax的表達 I/R早期Bax在海馬CA1區的表達明顯增強，隨着再灌注時間的延長，其表達量不斷增加，I/R 72～168 h達高峯。假手術組與I/R不同時間點組之間，Bax的表達均有顯著差異(P<0.01)(表2)。
2.3.3 Bcl?2/Bax比率變化 隨I/R時間的延長，Bcl?2/Bax的比率逐漸降低(表2)。表2 VD大鼠Bcl?2、Bax的表達水平與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01
2.4 流式細胞術檢測海馬神經細胞凋亡率結果 隨着I/R時間的延長，大鼠海馬神經細胞凋亡率逐漸增高，其中I/R 2 h組凋亡率最低，I/R 168 h組凋亡率最高。VD模型各時間組與假手術組比較，海馬神經細胞凋亡率明顯增加(P<0.01);I/R不同時間組間兩兩比較，各組間海馬神經細胞凋亡率均差異顯著(P<0.01)，見表3。
2.5 血清H2S含量檢測結果 隨着I/R時間的延長，大鼠血清H2S含量呈現直線降低趨勢，其中IR 2 h組血清H2S含量最高，I/R 168 h組血清H2S含量最低。VD模型各時間組與正常組和假手術組比較，血清H2S含量明顯減少(P<0.01);I/R不同時間組間兩兩比較，血清H2S含量均差異顯著(P<0.01);正常組和假手術組血清H2S含量無顯著差異(P>0.05)，見表3。
2.6 血清H2S含量與海馬神經細胞凋亡率相關分析 隨着血清H2S含量的降低，海馬神經細胞凋亡率逐漸升高，兩者呈現明顯的負相關，迴歸方程爲：y=-0.135x+12.068，相關係數r=-0.861(P<0.01)，提示內源性H2S可能具有保護神經細胞的功能。表3 各組海馬神經細胞凋亡率及血清H2S含量(各組間兩兩比較：1)P<0.01
3 討 論
目前認爲，I/R後神經元死亡的機制是損傷級聯反應，腦缺血性損傷級聯反應大多以能量衰竭和興奮性氨基酸毒性開始，以細胞凋亡結束。本實驗中用HE染色觀察到海馬CA1區大量細胞呈現明顯的凋亡特徵，VD模型組大鼠海馬CA1區可見神經元排列紊亂，神經元變性，體積變小，核固縮成三角形或不規則形，胞核與胞漿界限不清。流式細胞術檢測海馬神經細胞的凋亡率發現VD模型各組與假手術組相比海馬神經細胞凋亡率明顯增加，而且隨着I/R時間的延長，大鼠海馬神經細胞的凋亡率逐漸增加。