【摘要】 目的 探討維生素E(vitamin E，VE)能否抑制阿黴素(doxorubicin, DXR)的腎毒性。方法 用DXR，DXR與VE處理腎小球內皮細胞(CRL?1927)，通過鹼性彗星實驗檢測DNA損傷程度。結果 10 μmol/L DXR處理細胞後，彗尾長度明顯增加。DXR與VE共同處理細胞後，彗尾長度與DXR處理細胞相比明顯變短，並呈時間、濃度依賴性。結論 DXR造成了腎小球內皮細胞的DNA損傷，而VE抑制了DXR的腎毒性作用。
【關鍵詞】 維生素E 阿黴素 腎小球內皮細胞
【Abstract】 Objective To investigate whether vitamin E can inhibit the nephrotoxicity of ods After DXR with or without vitamin E treated renal mesangial cell (CRL?1927), alkaline comet assay was used to detect DNA damage. Results After 10 μmol/L DXR treated cells, the length of comet tails increased obviously. After DXR and VE treated cells together, the length of comet tails decreased in time and concentration?dependent manner when compared to that of control group. Conclusion DXR induced the damage of renal mesangial cell , VE inhibited the nephrotoxicity of doxorubicin.
【Key words】 vitamin E，doxorubicin( DXR)，renal mesangial cell
維生素E(vitamin E，VE)又稱生育酚，目前自然界有8種，包括α、β、γ與δ生育酚以及α、β、γ與δ生育三烯酚，其中α生育酚的生物活性最大[1]。VE作爲脂溶性抗氧化劑，不僅能清除自由基，還能阻斷脂質過氧化，進而保護細胞和組織免受由自由基誘導的氧化損傷[2],維持生物膜的正常結構[3]。環類抗生素阿黴素(doxorubicin，DXR)，是一種具有細胞毒性的化療藥物，廣泛地用於各種腫瘤的治療。DXR細胞毒性在殺傷腫瘤細胞的同時也導致了正常細胞組織的損傷，其腎毒性嚴格地限制了DXR的使用。故本實驗以DXR對腎小球內皮細胞的DNA損傷作用爲研究，探討VE是否能抑制DXR的腎毒性。
1 材料與方法
1.1 主要試劑 腎小球內皮細胞CRL?1927購於ATCC。最低必需培養基(Eagle’s minimum essential medium ，MEM )、L?2谷氨醯胺、小牛血清均爲美國Gibco 公司產品。VE 、DXR、二甲基亞碸(DMSO)及4’，6?二脒基?2?苯基吲哚(DAPI)均購於Sigma公司。Olympus A×70 熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，DYY?6C 型電泳儀購自北京市六一儀器廠。
1. 2 細胞培養 培養液包含DMEM、10%小牛血清、0.03% L?2谷氨醯胺、100 U /ml 青黴素、125 mg/L 鏈黴素。培養箱設置爲37 ℃、5% CO2環境。
1.3 藥物處理及細胞分組 VE溶於99.5%乙醇，DXR溶於培養液。10 μmol/L DXR分別與0.1 mmol/L，1 mmol/L VE合用處理細胞2 h，8 h和12 h。細胞分爲空白組(未經藥物處理)，溶劑對照組(99.5%乙醇處理)，陽性對照組(10 μmol/L DXR處理)，10 μmol/L DXR+0.1 mmol/L VE組，10 μmol/L DXR+1 mmol/L VE組。
1. 4 鹼性彗星實驗 藥物處理細胞後，離心收集，調節細胞濃度至6×1010/L 。製備“三明治”凝膠：首先用100 μl 0.65%正常熔點瓊脂糖，平鋪在毛面載玻片上，並蓋上蓋玻片，置於冰上8 min，使瓊脂糖凝固;移去蓋玻片，再在第一層凝膠上鋪單細胞懸液(15 μl 6×1010/L 細胞與75 μl 0.65%低熔點瓊脂糖混合) ;最後在第二層凝膠上鋪75 μl 0.65%低熔點瓊脂糖， 第二、三制膠方法同第一層。最後，移去蓋玻片，凝膠浸泡在4 ℃鹼性裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris base，1% sodium lauryl sarcosinate，1% Triton X?100 和10% DMSO 用前加入，pH=10 ) 中2 h。裂解完畢轉移至盛有高pH電泳緩衝液( 300 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA ) 中以25 V，300 mA 電泳20 min。DAPI 染色，熒光顯微鏡觀察結果。
1. 5 統計學處理 彗星實驗結果應用comet score 軟件分析尾相( TM )。實驗數據以 x±s表示, 採用SPSS 12.0 軟件進行單因素方差分析和Dunnett 檢驗, 顯著性界值採用P< 0.05。
2 結果
10 μmol/L DXR處理CRL?1 927細胞2、8、12 h，彗尾長度與對照組相比明顯增長。特別是處理細胞12 h後，彗尾長度由(4.61±0.67)μm增爲(17.56±1.98)μm(見表1)。DXR與0.1 mmol/L VE共同處理細胞12 h後，彗尾的長度與DXR組相比明顯變短，但明顯長於對照組;處理2、8 h時兩組彗尾長度無明顯差異。DXR與1 mmol/L VE共同處理細胞2 h後，彗尾長度與DXR處理組無明顯差異;處理細胞8、12 h後，DXR與1 mmol/LVE共同處理組彗尾的長度與DXR組相比明顯變短，但仍長於對照組，12 h時彗尾的.長度變化尤爲明顯(見圖1)。
表1 鹼性彗星實驗結果(略)
注：* 與對照組比較P<0.05或P<0.01;﹟與DXR組比較P<0.05或P<0.01
對照組 DXR組 DXR+1 mmol/LVE組
圖1 鹼性彗星實驗熒光圖片(12 h)(略)
3 討論
化療藥物DXR殺傷腫瘤細胞的同時也殺傷了正常細胞，常可在治療腫瘤的過程中造成組織損傷，因此其副作用限制了它在臨牀中的使用。因此如何提高用藥安全性或者降低藥物細胞毒性已經成爲了醫學界能否更好使用DXR的一大挑戰。DXR與抗氧化劑的合用爲減輕DXR毒性的有效方法之一。但迄今爲止，對DXR心毒性的防治研究較多，對其腎毒性的防治研究少且不明確。鹼性彗星實驗(alkali comet assay)，又稱單細胞凝膠電泳SCGE(single cell gel electrophoresis)，能夠檢測單SSB(single strand breaks)、雙鏈的斷裂和鹼性不穩定點ALS(alkali labile sites)[4]，是目前在單細胞水平上檢測DNA 微損傷的最有效方法之一。本研究主要是觀察DXR對腎小球內皮細胞的損傷以及抗氧化藥物VE與DXR合用時是否可保護細胞免受其損傷。
本研究首次發現了DXR可導致腎小球內皮細胞DNA的損傷。10 μmol/L處理CRL?1927細胞後，彗尾長度與對照組相比明顯增長。DXR處理細胞2 h後，彗尾長度爲(10.79±1.65)μm，8 h爲(14.31±2.10 )μm ，12 h爲(17.56±1.98) μm。因此證明了DXR對細胞的損傷具有一定的時間效應，可隨時間的延長其毒性明顯增加。其原因可能是DXR，蒽環類細胞週期非特異性藥物，促進了自由基的產生，自由基又使DNA 的鹼基和脫氧核糖發生化學變化, 引起鹼基改變、破壞或脫落，以及DNA單鏈斷裂(single strand breaks，SSBs )和雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)，DNA 與附近蛋白質可能形成DNA?蛋白質交聯等。