【摘要】 目的瞭解地衣芽孢桿菌菌體細胞中γ-谷氨酰轉肽酶的一些基礎酶學性質。方法 採用溶菌酶法破碎細胞壁，經硫酸銨沉澱後透析得到粗酶後，採用紫外分光光度法測定該酶的酶活力。結果 該酶在25~35℃的溫度範圍有很好的耐受性，在鹼性條件下保持一定的活性，最適反應溫度爲45℃，最適反應pH值爲8.0，Ca2+ 、Mg2+等金屬離子在適當濃度時對酶活性有促進作用。結論 本實驗爲利用該酶轉化生產茶氨酸提供了依據。
【關鍵詞】 γ-谷氨酰轉肽酶;酶學性質;茶氨酸
Abstract:Objective To understand some basic properties ofγ-glutamyltranspeptidase from Bacillus ods Lysozyme were used to disrupt the cell wall and ammonium sulfate were used to separate precipitation and dialysis,at last the crude enzyme were obtained. UV spectrophotometry were used to measured the enzyme activity. Results This enzyme was well tolerant to temperature in the range of 25~35 ℃,but in alkaline conditions,it maintained a certain activity,the optimum reaction temperature was 45 ℃ and optimum reaction pH 8.0,generally the appropriate concentration of metal ions,such as Ca2+,Mg2+,had a positive effect on the activity. Conclusion This experiment could be used in production of theanine with γ-glutamyltranspeptidase.
Key words: γ-glutamyltranspeptidase; enzymological property; L-theanine
γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP,EC ),又稱γ-谷氨酰轉移酶,在生物體內廣泛存在,是谷胱甘肽(GSH)代謝的關鍵酶之一。該酶還參與了氨基酸的跨膜轉運,可特異性催化γ-谷氨酰基的轉移反應[1]。人們對γ-GTP的早期研究侷限於該酶在GSH代謝中所起的作用[2]。隨着研究的深入,人們對γ-GTP的催化功能和分子結構有了更多的瞭解,並發現其在臨牀上可作爲肝膽疾病的生物標誌,被廣泛應用於肝病及其他臟器疾病的診斷和預後檢測[3-4] 。近年來,由於生物技術發展突飛猛進,生物催化與生物轉化技術在工業生產中逐漸興起,利用γ-GTP製備系列γ-谷氨酰基類化合物的研究已成爲生物催化領域的熱點。已有報道利用γ-谷氨酰基化(γ-glutamylization)反應合成了GG-DOPA等多種化合物[5-7]。目前，利用來源於枯草芽孢桿菌、基因工程改造的大腸埃希菌的γ-GTP生產茶氨酸[8] (L-theanine,γ-L-glu-ethylamide)越來越受到人們的關注。該方法利用γ-GTP將L-谷氨醯胺上的γ-谷氨酰基轉移到乙胺受體上,催化合成L-茶氨酸。但利用地衣芽孢桿菌發酵所產的γ-GTP轉化合成茶氨酸尚未見報道。本文利用實驗室篩選的γ-GTP高產菌株地衣芽孢桿菌發酵產酶，並研究該菌株所產的γ-GTP的基礎酶學性質，爲進一步利用地衣芽孢桿菌所產的γ-GTP生產茶氨酸提供依據。
1材料與方法
1.1主要材料與試劑
菌種：地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)由本實驗室篩選獲得。試劑：Tris 購自北京普博欣生物公司;L-γ-谷氨酰對硝基苯胺、雙甘肽均購自廣州威佳科技有限公司;硫酸銨爲國產分析純。
1.2地衣芽孢桿菌的產酶發酵
用接種環在活化好的菌種斜面上刮下一環菌種，將其轉入到種子培養基，30 ℃、240 r/min搖牀振盪培養16 h。以20%接種量轉接於發酵培養基(30 mL發酵液/300 mL三角瓶)中，在30 ℃下240 r/min搖牀培養28 h後收集菌體。
1.3γ-GTP粗酶的製備
γ-GTP發酵瓶培養液離心(4 800 r/min,10 min)，棄上清液，用TE緩衝液(Tri-HCl 緩衝液,pH 8.0，10 mol/L)重懸菌體,採用溶菌酶法以及硫酸銨鹽析法制備粗酶液。
1.4酶對溫度的耐受性