【摘要】 目的 瞭解青島地區結核分支桿菌耐吡嗪酰胺(PZA)分離株pncA基因突變的情況，探討其與耐PZA之間的關係。方法 應用BACTEC460培養系統對76例結核分支桿菌臨牀分離株進行結核分支桿菌常規培養和藥敏檢測，聚合酶鏈反應單鏈構象多態性(PCRSSCP)技術檢測pncA基因的突變。結果 76株結核分支桿菌臨牀分離株均經PCR擴增出結核分支桿菌複合羣保守序列IS6110基因片段，69株擴增出pncA基因的特異序列。後者包括：SSCP泳動異常者18株，其中耐藥株13株，敏感株5株;SSCP泳動正常者51株，其中耐藥株14株，敏感株37株。結論 青島地區結核分支桿菌臨牀分離株耐PZA主要分子機制之一爲pncA基因的突變;PCRSSCP技術能快速準確地檢測結核分支桿菌耐PZA基因pncA 的突變，可彌補常規藥敏試驗的不足。
【關鍵詞】 分支桿菌 結核 基因 pncA BACTEC培養方法 聚合酶鏈反應 單鏈構象多態性
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mutations of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA)resistance in Qingdao area. MethodsFrom 76 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis, the routine culture and drug susceptibility detection were done by BACTEC460 system, and the mutations of pncA gene detected by ltsAmong the 76 isolates, 44 strains were PZAsensitive and 32 PZAresistant by the BACTEC460 system. With PCRSSCP, 18 strains displayed abnormal pncA SSCP profile, in which, 13 were PZAeresistant and five PZAsensitive. Fiftyone strains displayed normal pncA SSCP profile, in which 14 were PZAresistant and 37 PZAsensitive. ConclusionMutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in pyrazinamideresistance of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. PCRSSCP appears to be a promising method for rapid detection of pyrazinamideresistant Mycobacterium tuberculosis, preferable to the routine drugsusceptibility test.
[KEY WORDS]Mycobacterium tuberculosis; genes, pncA; BACTEC; polymerase chain reaction; singlestrand conformation polymorphism
近年來,結核病疫情呈現全球性明顯回升趨勢，其主要原因之一是耐藥菌株的產生和播散，尤其是耐多藥菌株的涌現。目前對結核分支桿菌耐藥分子機制的研究主要集中在各種藥物的作用靶位及其相關基因的突變位點上。吡嗪酰胺(PZA)自1949年首次用於肺結核治療以來，作爲第一線抗結核藥物應用已有50多年的歷史。近幾年結核分支桿菌臨牀分離株對其耐藥趨勢日漸上升，並且呈現與異煙肼和利福平同時耐藥的現象[1]。然而，目前對PZA的作用機制及耐藥分子機制尚不清楚。本文應用BACTEC460培養系統進行結核分支桿菌常規培養和藥敏檢測，聚合酶鏈反應單鏈構象多態性技術(PCRSSCP)檢測結核分支桿菌pncA基因，旨在瞭解青島地區結核分支桿菌耐PZA分離株的pncA基因突變情況，探討其與耐PZA之間的關係,以建立新的、快速有效的結核分支桿菌藥敏試驗方法，彌補常規藥敏試驗的不足。
1 材料和方法
1.1 標本來源
76例結核分支桿菌臨牀分離株來自青島市結核肺病防治研究所2002年1～12月診治的肺結核病人。其中初治病人60例，復治病人16例;男43例，女33例;年齡21～83歲，平均52歲。
1.2 主要試劑與儀器
結核分支桿菌標準株(H37Rv)購自中國藥品生物製品檢定所，BACTEC460培養系統試劑購自BECTONDICKINSON公司，dNTP、 TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR Marker均購自Promega公司，PCR擴增儀爲PE公司480型。
1.3 痰標本的處理及PZA藥敏試驗
根據文獻[2]的方法進行菌種鑑定和藥敏試驗。痰標本經消化、離心，接種至含有C14棕櫚酸的12B培養基，37 ℃培養。第1週上機檢測生長指數(GI)值2～3次，以後每週測定1次，至第6周。結果判定標準如下：GI值0～10，培養陰性;GI值11～50，培養陽性;GI值51～100，可進行結核分支桿菌複合羣與非結核分支桿菌鑑定;GI值500～800，可進行藥物敏感性試驗。
結核分支桿菌陽性標本一部分提取DNA，-20 ℃保存備用;另一部分在12B培養基內加入定量PZA進行藥敏試驗，同時以蒸餾水代替PZA作爲對照。按以下標準判定結果：對照組的生長指數(AGI) 值>測試組的生長指數(△GI)值爲敏感;AGI值<△GI值爲耐藥;AGI值=△GI值爲臨界。
1.4 PCR檢測結核分支桿菌IS6110及pncA基因
1.4.1 PCR引物的設計與合成 根據Gene Bank中結核分支桿菌標準株H37Rv全基因序列,利用DNAStar軟件分別設計對應於結核分支桿菌複合羣保守序列IS6110及pncA基因序列的 PCR引物。其中引物INS1和INS2擴增IS6110基因，引物pncA1和pncA2擴增pncA基因。引物序列及擴增片段長度見表1。引物由上海生工生物公司合成(PAGE純化)，純水稀釋分裝，保存於-20 ℃備用。
1.4.2 目的基因的PCR擴增 取經BACTEC460培養系統培養陽性的增菌液1.5 mL於無菌乾燥玻璃試管中，酚氯仿法提取DNA。以提取的DNA爲模板進行PCR擴增，其循環條件爲：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環;72 ℃延伸10 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。表1 引物序列及其產物
1.5 PCRSSCP分析
pncA的PCR擴增產物變性後經80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色後可見野生型的單鏈DNA與H37Rv標準對照的單鏈DNA位於同一位置，而突變型的單鏈DNA低於或高於H37Rv標準對照的單鏈DNA水平，以此來確定突變例數。
2 結 果
2.1 BACTEC460培養系統檢測
從130份臨牀痰標本中共檢出76株結核分支桿菌，陽性率爲58.5%。其中對PZA敏感44株，耐藥32株，耐藥率爲42.1%。
2.2 PCR擴增
本文76株結核分支桿菌臨牀分離株均擴增出IS6110基因(245 bp)的目的條帶，與H37Rv標準株一致，表明這些臨牀分離株均爲結核分支桿菌。69株擴增出pncA基因的特異序列(254 bp)。7株未檢出pncA基因擴增產物，其中耐藥5株，敏感2株(圖1)。