作者(冒號)：林傑 徐力辛 楊德業 黃偉劍 林捷 張懷勤
【摘要】 ［目的］觀察川芎嗪（TMP）對體外培養內皮祖細胞（EPCs）功能影響和損傷保護作用，探討它對冠心病的治療作用。［方法］密度梯度離心法獲取臍血單個核細胞,培養7天后,收集貼壁細胞，流式細胞儀、熒光顯微鏡法、matrigel試劑鑑定EPCs。收集貼壁細胞並分組為正常對照組，TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）干預組，H2O2（500μmol/L）氧化應激模型組，TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）和H2O2共同干預組，培養24h。分別觀察EPCs增殖、粘附能力及凋亡率。［結果］與正常對照組相比,（5mg/L、25mg/L、100mg/L）TMP干預組對臍血來源的EPCs增殖、粘附功能無顯著影響，（200mg/L）TMP干預組顯著抑制臍血來源的EPCs增殖、粘附；與H2O2氧化應激損傷組相比，（5mg/L、25mg/L、100mg/L）TMP能顯著降低H2O2對EPCs增殖、粘附抑制作用及細胞凋亡。［結論］低濃度TMP能保護EPCs氧化應激損傷，改善增殖、粘附能力，減少細胞凋亡，但對正常培養的EPCs增殖和粘粘功能無顯著的促進或抑制作用。
【關鍵詞】 川芎嗪 內皮祖細胞 過氧化氫 缺血性疾病 冠心病
Abstract(冒號)：［Objective］ This study was to investigate the effect of TMP on function of EPCs in normal or hydrogen peroxide（H2O2）inducing injury model cell culture，and to approach a therapy to coronary heart disease（CHD）.［Method］ Total mononuclear cells were isolated from the cord blood by ficoll density gradient centrifugation，cultured in r the cells cultured for 7 days，identified them by cellmarkers and the ability of intaking the ac?LDL，and made sure they were divide the cells into three groups，TMP（5,25,100，200mg），H2O2（500μΜ）model and TMP together with H2O2，cultured for 24h and then detected the function and apoptosis of EPCs.［Result］ Versus to control group，the TMP （5，25，100mg）groups had no important effect on the proliferation and adhesion of EPCs，but TMP （200mg）group had negative effect on us to H2O2 model group，TMP （5，25,100mg）preincubated groups had important protective effect on EPCs in proliferation，adhesion and apoptosis.［Conclusion］ TMP could protect EPCs from oxidative stress injury，but had little benefit to EPCs in normal incubation.
Key words(冒號)：tetramethylpyrazine；endothelial progenitor cell；hydrogen peroxide；ischemic disease；coronary heart disease
內皮祖細胞（EPCs）的概念提出已有10年，目前普遍認為EPCs的表面標記為CD34、CD133、KDR，能進1步分化為成熟血管內皮細胞參與血管新生的幹/祖細胞。川芎嗪（TMP）是從活血化瘀中藥川芎的根莖中提取的有效成分,對臍靜脈內皮具有促增殖和內皮損傷保護作用［1］，並能抑制內皮細胞增殖及新生血管形成［2］，已應用到部分臨牀心、腦血管等疾病的治療並取得較好的療效［3］。而TMP對EPCs功能影響和損傷及保護作用，尚未見報道。本實驗旨在觀察TMP對體外培養正常和損傷EPCs的功能影響。
1 材料和方法
1.1 材料 6％羥乙基澱粉購自Sigma公司，纖維連接蛋白購自Roche公司，VEGF購自PeprotechEC公司，PE?CD34購自Caltag laboratories,FITC－VE?cadherin購自Bender system公司，PE?VEGF?2及FITC?AC133購自R＆D System,胎牛血清、購自GIBCO公司，Dil?ac?LDL購自Molecular probe公司，FITC?UEA、TMP購自Sigma公司，CCK?8細胞計數試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所，matrigel購自BD biosciences公司。
1.2 方法
1.2.1 人臍血培養EPCs臍血採集於温州醫學院附屬第1醫院產科分娩室（已獲得知情同意）。培養參考文獻［4］，取健康孕婦分娩後臍血50ml,以密度梯度離心法分離臍血中單個核細胞,以5×107cells度接種於包被有纖維連接蛋白的25cm2培養瓶中,每皿加入5ml包含有20%胎牛血清、VEGF（10μg·L-1）,青黴素（105U/L）及鏈黴素（105U/L）的M199培養液,置37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。3d後,洗去未貼壁細胞,添加培養液繼續培養,以後每隔3d換培養液。
1.2.2 EPCs鑑定 在培養第3天時形成細胞集落；在培養的第7天細胞以0.25%胰酶消化後,製成109·L-1的單細胞懸液,加入熒光標記的抗CD34、VE?Cadherin、VEGFR?2及CD133單株抗體各10μl（1g·L-1）,流式細胞儀分析其表達情況；將DiI?ac?LDL以2.4mg·L-1的終濃度加入培養液共孵育3h,2％的多聚甲醛固定10min,再加入3ulFITC?UEA,（避光操作），37℃孵育1h，熒光顯微鏡下觀察，以不加DiI?ac?LDL和FITC?UEA的同批培養細胞為對照，陰性對照採用SGC7901；將matrigel試劑、96孔培養板以及槍頭於4℃冰箱過夜，在冰上操作，取50ulmatrigel試劑每孔，於37℃孵育半小時成膠待用，0.25%胰酶消化後製成細胞懸液接種於鋪好成血管試劑的96孔板，培養48h在倒置顯微鏡下觀察管腔形成
1.2.3 分組 培養第7天的`各組細胞以0.25%胰酶消化後,製成細胞懸液計數，分為正常對照組、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）干預組、H2O2（500umol/L）氧化應激模型組［6］、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L）預處理6h後和H2O2共同干預組，共培養24h後進行增殖、粘附功能及細胞凋亡的檢測。
1.2.4 增殖能力測定 製成細胞懸液計數，將等數量EPCs接種到96孔培養板隨機分為各組,每組6孔,培養48h後,棄培養液加入100μl新鮮含3％胎牛血清M199培養液，每孔10μLcck?8，37℃培養2.5h後,置酶標儀于波長450nm處測吸光度值（A）。
1.2.5 粘附能力測定 製成細胞懸液,以為1×104/cm2的接種密度接種到24孔板,分為各組每組3孔,培養48h後,各組細胞以0.25%胰酶消化製成細胞懸液，以相同細胞數接種96孔板每組6孔,置37℃培養箱中培養30min,洗去未貼壁細胞,倒置顯微鏡下隨機選取10個視野（×400）計數粘附細胞數。
1.2.6 細胞凋亡檢測 在培養的第7天之後，以0.25%胰酶消化下來製成細胞懸液,以5×105cells接種6孔板，0.25%胰酶（不含EDTA）將各孔細胞消化,PBS洗兩次成細胞懸液,收集1×105cells離心，加入500μl Binding Buffer重懸浮細胞，加入2μl Annexin V?FITC混勻後，加入5μl Propidium Iodide（PI）染料，混勻、避光、室温反應10min，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡情況。Annexin v單陽性為早期凋亡細胞，以正常組早期凋亡率為100％,計算各組與正常組早期凋亡率之比。
1.2.7 統計分析 所有結果以x±s表示,輸入SPSS13.0軟件包，採用單因素方差分析比較各組均數,P<0.05為有顯著性差異。
2 結果
2.1 EPCs鑑定 培養3d後形成集落（圖4），培養第7天用流式細胞儀分析表明,表達CD34、CD133、VEGFR?2、VE?Cadherin的細胞分別為（78.51±5.53）%、（10.15±4.45）%、（15.24±3.61）%及（64.48±6.56）%。熒光顯微鏡檢顯示(冒號)：細胞吞噬DiI?ac?LDL，顯微鏡下激發紅色熒光（圖1）,細胞吞噬FITC?UEA，發綠色熒光（圖2），兩圖重疊見圖3。空白對照及陰性對照均無熒光。血管生成matrigel試劑盒檢測EPCs的體外成血管能力。細胞拉長變形,長度為寬度的4倍以上即可被認為形成小管狀，典型血管狀為梭形細胞圍成的多邊形官腔樣（圖5）。體外培養14d後可形成條索狀結構（圖6）。
2.2 對EPCs增殖、粘附功能的影響 由表1可知，與對照相比，TMP在5～200mg/L濃度範圍內，低濃度的TMP對EPCs增殖、粘附能力無顯著促進或抑制，高濃度TMP則抑制EPCs增殖、粘附功能；與H2O2氧化應激模型相比，低濃度的TMP可顯著降低H2O2對EPCs的增殖、粘附功能損傷。
2.3 對EPCs早期凋亡率的影響 由表1可知，TMP在濃度5～100mg/L範圍內對H2O2致EPCs凋亡起保護作用。
圖1 細胞吞噬DiI?ac?LDL（×100）（略）
圖2 細胞吞噬FITC?LEA（×100）（略）
圖3 DiI?ac?LDL與FITC?LEA重疊熒光圖（略）
圖4 培養3d後形成集落（×100）（略）
圖5 多邊形官腔樣（×100）（略）
圖6 14d後形成條索狀結構（略）
表1 不同濃度的TMP對外周血EPCs的增殖、粘附功能及凋亡影響（略）
Note(冒號)：Versus to control group，*P<0.05，**P<0.01,Versus to H2O2 group,△P<0.05，△△P<0.01
3 討論
從1997年ashara等［7］發現成體存在皮祖細胞，EPCs作為1種可以形成新生血管和分化為成熟血管內皮細胞的種子細胞的研究方興未艾並取得了1系列巨大的研究成果。臨牀上缺血性疾病尤其是冠心病往往合併有1種或多種心血管疾病危險因素。心血管危險因素的數量與循環中的EPCs的數量呈負相關，因而有學者認為循環中EPCs的數量可以作為冠心病預後的指標。提示提高循環中EPCs的數量和改善其功能有助於防治心血管疾病。Dernbach等［6］研究發現與臍靜脈內皮細胞相比EPCs具有較低的活性氧水平，以往實驗已證明氧化應激損傷可縮短端粒，促使細胞衰老、凋亡［9］。而TMP對冠脈內皮損傷、缺血再灌注心肌損傷的保護作用與超氧歧化酶、1氧化氮合酶水平顯著升高相關作用［10］。
本實驗發現低濃度的TMP對正常培養EPCs增殖、粘附功能無顯著促進或抑制，高濃度則起抑制作用。H2O2是活性氧，促進大量氧化自由基和脂質過氧化，損傷細胞活性，促使細胞衰老及凋亡。低濃度TMP和H2O21起干預培養很顯著降低H2O2對EPCs活性抑制。推測TMP對EPCs損傷保護作用可能同清除氧化自由基，抑制胞內鈣超載，增強抗氧化酶的活性，抑制端粒加速縮短有關，具體的調節途徑有待能進1步實驗明確。本實驗為TMP對治療合併有高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化的冠心病可行性提供了1定的理論支持。
【參考文獻】
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