【關鍵詞】 ，，膽結石
［摘要］ 目的：探討中藥升清膠囊在分子層面防治膽石病的機制。方法：雌性豚鼠60只，隨機分成正常組（喂正常飲食作為對照）、模型組（喂低蛋白飲食致石）和中藥組（喂低蛋白飲食致石加中藥升清膠囊治療）。6周後處死並取材，觀察動物成石情況，檢測肝組織膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶（bilirubin UDPglucuronosyltransferase， BUGT）mRNA及膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7αhydroxylase， CYP7A1）mRNA表達。結果：各組豚鼠成石比例分別為正常組2/14、模型組為9/11、中藥組為4/14，組間有顯著差異（P＜0。05），正常組和中藥組豚鼠的肝組織BUGT mRNA及CYP7A1 mRNA表達明顯高於模型組（P＜0。05）。結論：中藥升清膠囊可能是通過上調肝組織中BUGT mRNA和CYP7A1 mRNA的表達，干預膽紅素和膽固醇代謝，抑制致石性膽汁形成，起到預防膽結石的作用。
［關鍵詞］ 膽結石; 升清膠囊; BUGT; 膽固醇7α羥化酶; 基因
Effects of Shengqing Capsules on cholelithiasisrelated genes in guinea pigs
ABSTRACT Objective： To explore the molecular mechanisms of Shengqing Capsules in treating cholelithiasis。 Methods： Sixty female guinea pigs were randomized into 3 groups： group Ⅰ （fed with normal diet）， group Ⅱ （fed with lowprotein diet） and group Ⅲ （fed with lowprotein diet and Shengqing Capsules）。 After sixweek feeding， the gallstone formation and the expressions of bilirubin UDPglucuronosyltransferase （BUGT） mRNA and cholesterol 7αhydroxylase （CYP7A1） mRNA were observed。 Results： The proportions of stoneformed in groups Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ were 2/14， 9/12 and 4/14， respectively。 There were significant differences among the three groups （P<0。05）。 The expressions of BUGT and CYP7A1 mRNAs were higher in both group Ⅰ and group Ⅲ as compared with those in the group Ⅱ （P＜0。05）。 Conclusion： Shengqing Capsules can reduce the rate of stoneformation， which may be due to its interference of metabolism of bilirubin and cholesterol and upregulation of the expressions of BUGT and CYP7A1 mRNAs。
KEY WORDS cholelithiasis; Shengqing Capsules; BUGT; cholesterol 7αhdroxylase; gene
膽石病屬中醫“脅痛”、“黃疸”等範疇，歷代醫家積累了豐富的治療經驗。作者曾在已故外科專家顧伯華教授和徐長生教授採用疏肝利膽法治療本病取得較好療效的經驗基礎上，總結和開發了治療肝膽氣鬱型膽石病的中成藥膽寧片。近年，作者又從小複方角度進一步精簡膽寧片的藥味，研製開發出治療膽石病的新一代中成藥升清膠囊，並在此前的研究中發現該藥能從膽石病發病的樞紐環節肝細胞水平阻斷致石性病理性膽汁的形成，顯著降低實驗動物膽色素結石的成石率［1］。為進一步探討升清膠囊在分子層面防治膽石病的機制，開展了以下研究。
1 材料與方法
1。1 實驗材料
1。1。1 實驗動物 紅目雌性豚鼠，清潔級，共60只，體質量250～300 g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。
1。1。2 藥物 升清膠囊，主要藥物組成為大黃、虎杖和陳皮，上海中醫藥大學龍華醫院製劑室提供乾粉劑。
1。1。3 飼料 正常飼料，由上海申旺實驗動物中心提供。造模用致石性飼料，在正常飼料基礎上添加致石藥物。具體配方為：正常飼料45。43 g，致石性藥物4。57 g（其中酪蛋白1 g、蔗糖1。5 g、豬油1 g、微晶纖維素1 g、膽酸0。02 g、膽固醇0。05 g）。
1。1。4 主要試劑 焦碳酸二乙酯（DEPC），去氧核苷三磷酸（10 mmol/L），隨機引物（100 μmol/L），彩頭生物技術公司產品；RNA提取試劑Trizol，Taq聚合酶（5 U/μl），Gibco公司產品；MMuLV逆轉錄酶（200 U/μl），核糖核酸酶抑制劑（RNAsin，40 U/μl），Promaga公司產品；DNA標記物（100 bp），生工生物技術公司產品。豚鼠膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶（bilirubin UDPglucuronosyltransferase， BUGT）上游引物（270289， 20 bp）： 5’ACT GGG CAA CGC TAA GAA GG3’；下游引物（531512， 20 bp）： 5’TAT GCC ACA GGG AAC AGA GC3’；PCR產物長度：262 bp。豚鼠膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7αhydroxylase， CYP7A1）上游引物（812832， 21 bp）： 5’GTT TCT CAA TGA CAC GCT CTC3’；下游引物（12491229， 21 bp）： 5’AAA GTC AAA GGG TCT GGG TAG3’；PCR產物長度： 438 bp。豚鼠內參βactin上游引物（30 bp）： 5’TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG3’；下游引物（30 bp）：5’GCT AGA AGC ATT TGC GGT GCT CGA TGG AGG3’；PCR產物長度：286 bp。
1。1。5 主要儀器 －85 ℃/371 L ELTBLV超低温冰箱，美國Harris公司；AA200DS電子天平，美國G&G公司；勻漿器，美國Wheaton公司；低温離心機，日本久保田公司；平面電泳儀，LKB激光灰度掃描儀，瑞典Pharmacia公司；LNGT83真空離心濃縮乾燥器，太倉市華美生化儀器廠；DZF3型乾燥箱，上海頓克儀器科技有限公司；DSHZ300型多用途水浴恆温振動器，上海一恆科技有限 公司；X700型照相機，日本美能達公司；紫外線透射反射儀，北京利康達聖科技發展有限公司；752分光光度計，上海測維光電技術有限責任公司；DNA Amp Cycler 9600 PCR熱循環儀，9600型PCR基因擴增儀，KS400型計算機圖像分析系統，美國PerkinElmer公司。
1。2 實驗方法
1。2。1 造模方法 採用本科室首創的低蛋白致石飲食所致的豚鼠膽結石模型［1］。將豚鼠置實驗室籠養，每籠5只，先餵養正常飼料1周以適應環境，造模時喂以致石性飼料，造模期間不限飲食量，自由飲水，控制青菜量。
1。2。2 動物分組 將60只豚鼠隨機分為3組，即正常對照組（正常組）15只、致石飼料造模組（模型組）25只、致石飼料造模並經中藥升清膠囊治療組（中藥組）20只。正常組喂以正常飼料及適量青菜；模型組喂以致石飼料及少量青菜（相當於正常組的1/10）；中藥組在喂以致石飼料及相當於模型組青菜量的同時，加喂中藥升清膠囊，其中正常飼料和致石飼料均不限量。
1。2。3 給藥方法 先將升清膠囊乾粉劑按89 mg/ml濃度配製成乾粉溶液。中藥組按10 mlkg1d1喂以升清膠囊乾粉溶液。模型組及正常組灌以生理鹽水，按10 mlkg1d1灌胃。均分2次灌胃，連續6周。
1。2。4 標本採集 用15％烏拉坦以1 g/kg劑量腹腔注射麻醉，新潔爾滅酊消毒皮膚後，打開腹腔，抽取後腔靜脈血，止血鉗鉗夾膽囊管，肉眼觀察成石情況，用1 ml皮試針筒抽取膽汁後充氮，－20 ℃避光保存（供生化檢測，另文報道），完整切除膽囊，剖開，再仔細觀察成石情況。取相同部位肝組織約1 cm×1 cm×1 cm，用10%固定作光鏡檢查。從各組中每組隨機抽取5只，切取2 mm×2 mm×2 mm肝組織，用2%戊二醛固定，待作電鏡觀察（另文報道）。其餘肝組織置液氮中保存。
1。3 觀察指標
1。3。1 大體情況及體質量變化 觀察各組動物飲食、體質量變化、皮毛光澤度、活動情況及成活率等。
1。3。2 膽囊成石率 撥開膽囊，以肉眼觀察膽囊內有無膽石或膽泥作為判斷動物結石的標準，記錄各組動物成石情況。
1。3。3 肝組織膽石病相關基因BUGT及CYP7A1 mRNA表達 依據彩頭生物技術公司提供的操作説明，配製相關的實驗工作液，並完成組織總RNA抽提、RT反應、PCR、電泳等步驟。隨後用KS400型圖像分析系統對電泳凝膠的底片進行光密度掃描，以目的基因光密度值與對應樣品內參基因光密度值的比值作為該樣品中目的基因的相對轉錄量，最後以目的基因的相對轉錄量為參數進行統計分析。
1。4 統計學方法 用SPSS 10。0進行單因素方差分析，計數資料按Ridit法計算u值。
2 結 果
2。1 各組豚鼠大體情況 造模過程中正常組死亡1只，模型組死亡14只，中藥治療組死亡4只。模型組豚鼠明顯消瘦，皮毛欠光澤，容易脱落，活動遲緩，反應遲鈍。治療組皮毛稍欠光澤，其餘情況與模型組大體相似。正常組皮毛欠光澤，反應靈敏，活動敏捷。
2。2 各組豚鼠體質量 實驗第1周，3組動物的.體質量無明顯差異，見表1；經過6周的餵養，正常組和中藥組動物的體質量明顯高於模型組，見表2 表1 實驗第1周時各組豚鼠體質量表2 實驗第6周時各組豚鼠體質量
2。3 各組豚鼠成石率 動物膽囊所見結石外形不規則，呈棕黑色泥沙樣或棕色絮狀沉澱。經紅外光譜鑑定，為膽紅素結石。各組成石率的結果經統計學檢驗，模型組與正常組和中藥組相比均有統計學差異。見表3。 表3 各組豚鼠成石率
2。4 BUGT及CYP7A1 mRNA表達 中藥組動物肝組織BUGT mRNA和CYP7A1 mRNA的表達雖低於正常組，但顯著高於模型組。見表4。表4 豚鼠肝組織BUGT和CYP7A1 mRNA表達
3 討 論
3。1 升清膠囊在膽色素結石動物模型中具有干預結石形成的作用 本課題組於1982年率先在國內建立豚鼠膽色素結石模型，在課題組已完成的多項研究中均證實本實驗所採用的膽色素結石造模方法具有成石率高、重複性強的優點［2］。本研究發現低蛋白致石飼料餵養6周後，模型組豚鼠膽色素結石成石率達到82%，與正常組比較差異顯著（P<0。01）。經過紅外光譜檢測，其結石成分主要為膽色素，提示成功建立了膽色素結石模型。經中藥升清膠囊預防性干預後，豚鼠膽色素結石成石率下降至31%，與模型組比較有顯著差異（P<0。05），證明該中藥具有明顯的防石作用。
3。2 升清膠囊在分子水平對膽石病的影響 膽結石的形成中，膽固醇和膽紅素這兩大類物質扮演了重要的角色，致石性膽汁中主要成分變化也即發生在這兩大類物質中，而在分子水平上對這類物質的調控可能是阻止膽石病發生髮展的關鍵。
3。2。1 升清膠囊對膽石病相關基因BUGT表達的影響 據流行病學資料［3，4］，有膽石病家族史者及Gilbert綜合徵（先天性家族性高膽紅素血癥）患者膽石發病率較高，提示膽石的形成可能存在基因水平異常。機體通過膽紅素的葡萄糖醛酸化使脂溶性的遊離膽紅素（unconjugated bilirubin， UCB）變成水溶性的結合膽紅素（conjugated bilirubin， CB），隨之排出體外，在這一過程中肝臟BUGT起着關鍵作用［5］。人體每天產生一定量的UCB，UCB的酯化是維持膽紅素溶解於各種體液中並順利完成生理功能的重要因素。有關膽石的研究指出：膽色素結石患者的膽汁中，膽紅素的總量並無顯著升高；而是遊離型膽紅素佔總膽紅素的比值明顯高於正常（<2%），而且膽汁總體溶解度下降，這充分提示遊離型膽紅素對成石的重要性［6］。人體通過膽紅素的葡萄糖醛酸化使脂溶性的UCB變成水溶性的CB，隨之排出體外，BUGT在這一過程中起關鍵作用。
本實驗發現，正常組動物BUGT基因mRNA表達量顯著高於模型組（P<0。05），提示致石飲食中的某些因素干擾了BUGT基因mRNA表達，可能導致BUGT的活性降低，影響膽紅素的葡萄糖醛酸化，促使結石的形成。而中藥組BUGT基因mRNA相對錶達量高於模型組，兩組比較差異顯著（P<0。05）。雖然BUGT基因mRNA相對錶達量在中藥組與正常組之間也有差異（P<0。05），但差異程度明顯小於模型組。表明治療組對致石飲食作用下豚鼠的肝臟BUGT基因mRNA表達有上調作用。升清膠囊這種對BUGT基因表達的上調作用，可能是其在分子層面干預結石形成的重要機制。
3。2。2 升清膠囊對膽石病相關基因CYP7A1表達的影響 內源性膽固醇合成增加，膽酸合成減少，是造成膽汁膽固醇過飽和的常見原因。β羥β甲基戊二酰輔酶（βhydroxyβmethylglutaryl coenzyme A， HMGCoA）還原酶及CYP7A1分別是膽固醇及膽酸合成的限速酶，肝臟在調節膽固醇體內平衡中起重要的作用［7~9］。通常根據甾醇核修飾反應和側鏈氧化剪切反應的先後將膽汁酸的生物合成途徑分為經典途徑和替代途徑。不溶於水的膽固醇轉化成水溶性膽汁酸的過程，在體內約40%是通過經典途徑被代謝的［10］。CYP7A1是經典途徑的起始酶，它的活性代表着機體清除膽固醇的能力。有人對肝內膽管結石患者肝臟HMGCOA還原酶及CYP7A1基因mRNA丰度及酶的活性檢測發現，原發性膽管內膽固醇合成的向上調節及膽酸合成的向下調節，導致了膽汁膽固醇過飽和及含豐富膽固醇的色素結石的形成，膽石症患者的CYP7A1 mRNA水平低於一般人羣［11］。
在本實驗中，模型組與正常組相比，CYP7A1 mRNA水平有明顯差異（P<0。05），提示模型組動物在致石飲食作用下，CYP7A1基因表達下降，膽固醇轉變成膽汁酸受阻，膽汁中膽固醇增加，促使結石形成。而中藥組CYP7A1基因mRNA相對錶達量雖稍低於正常組，但明顯高於模型組（P<0。05）。表明治療組對低蛋白致石飲食作用下豚鼠的肝臟CYP7A1基因mRNA的表達有上調作用。升清膠囊可能通過上調CYP7A1基因表達，在一定程度上增加膽汁酸的合成，降低膽汁膽固醇濃度，預防致石膽汁的形成，達到防止結石形成的目的。
［參考文獻］
1 宋華榮， 朱培庭， 張靜， 等。 膽石淨溶石作用的實驗研究［J］。 上海中醫藥大學學報， 2002， 16（2）： 4244。
2 徐長生， 朱培庭， 曹中平， 等。 膽色素結石的動物模型及藥物防治的實驗研究［J］。 中華消化雜誌， 1982， 2（1）： 3436。
3 Leoci C， Chiloiro M， Guerra V， et al。 Genetic epidemiology of choleli thiasis： A casecontrol study of a population［J］。 Minerua Gastroenterol Dietol， 1991， 37（1）： 3539。
4 Pannwitz H， Nurnberg D， Berndt H。 Epidemiology of gallbladder calculi in young females［J］。 Leber Magen Darm， 1990， 20（4）： 189194。
5 楊文奇， 祝學光， 張紅軍， 等。 肝臟膽紅素葡萄糖醛酸化障礙對膽石形成的作用［J］。 中華消化雜誌， 1999， 19（1）： 6768。
6 吳階平， 裘法祖主編。 黃家駟外科學［M］。 第6版。 北京： 人民衞生出版社， 2002。 1282。
7 Shoda J， He BF， Tanaka N， et al。 Primary dual defect of cholesterol and bile acid metabolism in liver of patients with intrahepatic calculi［J］。 Gastroenterology， 1995， 108（5）： 15341546。
8Javitt NB。 Choleserol homeostasis： role of the LDL receptor［J］。 FASEB J， 1995， 9（3）： 13781381。
9 Brown MS， Goldstein JL。 A receptormediated pathway for cholesterol homeostasis［J］。 Science，1986， 232（4746）： 3437。
10 Vlahcevic ZR， Heuman DM， Hylemon PB。 Regulation of bile acid synthesis［J］。 Hepatology， 1991， 13（3）： 590600。
11 Rudling M。 Hepatic mRNA levels for the LDL receptor and HMGCOA reductase show coordinate regulation in vivo［J］。 J Lipid Res， 1992， 33（4）： 493501
論文關鍵字：升清膠囊，豚鼠膽石病相關基因，影響