【摘 要】目的：觀察苗藥痛風停對尿酸鹽結晶誘導的SD模型大鼠急性痛風性關節炎的關節腫脹度、步態分級、滑膜病理、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響，探討苗藥痛風停對急性痛風性關節炎的作用機制。方法：將60只SD大鼠隨機分爲空白對照組，苗藥痛風停低、中、高劑量組，雙氯芬酸鈉組，模型對照組，每組10只。除空白對照組外，其餘分別建立以尿酸鹽結晶誘導的大鼠急性痛風性關節炎模型，分別觀察和測量造模前及造模後6，12，24，48 h大鼠關節橫徑，並計算關節腫脹度;觀察大鼠24，48 h步態分級;造模後48 h處死大鼠，用酶聯免疫吸附法測定細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。結果：各治療組對大鼠關節腫脹度、步態分級、滑膜病理改變和IL-1β、IL-6、TNF-α的表達有不同程度的改善，苗藥痛風停中、高劑量組與雙氯芬酸鈉組比較，差異無統計學意義(P > 0.05)。結論：苗藥痛風停能夠改善尿酸鹽結晶誘導的SD模型大鼠急性痛風性關節炎關節腫脹度、步態分級及滑膜病理改變;苗藥痛風停降低尿酸鹽結晶誘導的SD模型大鼠細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達，以中、高劑量作用明顯，並呈劑量依賴性。
【關鍵詞】 痛風性關節炎;細胞因子;苗藥痛風停;尿酸鹽;實驗研究
痛風(gout)是體內嘌呤代謝紊亂及/或排泄減少導致尿酸鹽(monosodium urate，MSU)沉積所引起的晶體性關節病。痛風在我國的患病率約爲0.15%～0.67%，較以前有明顯升高[1]。痛風性關節炎常常合併有心血管疾病、高血壓、2型糖尿病、肥胖、高脂血症、代謝綜合徵、慢性腎臟疾病和腎結石等[2]，而這些合併症往往是NSAIDs和/或秋水仙鹼常見的禁忌症[3]。細胞因子白細胞介素IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等的高表達可導致、加重MSU結晶誘導的急性炎症的發生和發展[4]。中醫學對痛風治療有深入的認識，積累了豐富的'臨牀經驗。苗藥痛風停根據中醫理論和苗醫理論對痛風認識的結合而遣方組藥，由白虎加桂枝湯加減苗藥組成，通過本課題組多年臨牀觀察、臨牀研究和實驗研究，其治療急性痛風性關節炎療效顯著，安全性好，緩解痛風性關節炎效果明顯，並具有降尿酸作用[5-7]。在前期實驗研究中，筆者已經證實苗藥痛風停能夠抑制SD大鼠急性痛風性關節炎IL-8、環氧化酶-2(COX-2)的表達，減輕關節滑膜炎症[8-9]。本文旨在探討苗藥痛風停對IL-1β、IL-6和TNF-α的影響。
1 實驗材料
1.1 實驗動物 清潔級健康雌雄SD大鼠60只，體質量(200±20)g，由重慶滕鑫生物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(渝)2014-0009。
1.2 主要試劑及儀器 尿酸鈉(美國Sigma公司，批號BCBH7155V);吐溫80(美國Amresco公司，批號20090120);多粘菌素B(美國Amresco公司，批號2013105156);氨基酸乙脂(上海伊卡生物技術有限公司，批號EK131219);質量分數爲4%的多聚甲醛溶液(上海博谷生物科技有限公司，批號PT028);IL-1β ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司，批號CK-E30419R);IL-6 ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司，批號CK-E30646R);TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司，批號CK-E30635R);酶標儀(美國BioTek有限公司，批號Synergy TM);顯微鏡(日本OLYMPUS公司，批號BX51T-PHD-J11);CMOS(日本OLYMPUS公司，批號BX51T-PHJ-D17);切片機(德國Leica公司，批號RM2015);冷凍離心機(北京離心機廠，批號LDZ5-2型);電子天平(瑞士METTER，批號AE100型);低溫冰箱(日本SANYO公司，批號MDF-382E型);電子游標卡尺：貴陽中醫學院基礎實驗室提供。
1.3 實驗藥物 苗藥痛風停由生石膏15 g、知母12 g、黃柏12 g、川萆薢10 g、薏苡仁12 g、砂仁12 g、川牛膝15 g、甘草6 g等，加苗藥觀音草12 g、芭蕉根12 g、絡石藤15 g、大血藤15 g等組成。以上生藥均購於貴陽中醫學院第二附屬醫院。取上藥煎湯濃縮，質量分數按實驗需求的低、中、高分組分別濃縮至1.54，3.08，6.16 g・mL-1，置於4 ℃冰箱保存。雙氯芬酸鈉緩釋片(四川花新制藥有限公司，批號H19991402)，臨用時將藥片充分研磨後用無菌蒸餾水配製成混懸液，然後配製成1.54 mg・mL-1的混懸液備用。
2 方 法
2.1 實驗動物分組 將60只SD大鼠隨機分爲空白對照組，苗藥痛風停低、中、高劑量組，雙氯芬酸鈉組，模型對照組，每組10只。
2.2 造模方法 將大鼠步態分級[10-11]作爲各組SD大鼠的篩選標準，未達到0級標準的SD大鼠則剔除不用。具體造模方法：依據Mc Carty DJ[12]的經典造模方法，先用質量分數爲20%的烏拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉，然後常規消毒大鼠右側膝關節皮膚，稍彎曲膝關節，從關節正中或側方用6號注射針進針，將尿酸鈉溶液10 mg(0.4 mL)及多粘菌素B 0.1 mL(10 U・mL-1)注入大鼠膝關節腔，空白對照組予相同劑量的生理鹽水關節腔注射。整個實驗過程中，有3只大鼠因灌胃不當死亡，2只大鼠因麻醉過深死亡，爲保證樣本數量，及時填補。
2.3 給 藥 各組SD大鼠在相同條件下自由飲食1周後，開始灌胃。根據成人與大鼠用藥等效劑量換算，中劑量等於將成人用藥劑量換算爲大鼠用藥劑量，中劑量減半則爲低劑量，中劑量加倍則爲高劑量。苗藥痛風停低、中、高劑量組分別按質量分數不同每隻灌胃2 mL，即低、中、高劑量組分別爲每隻1.54，3.08，6.16 g・d-1;雙氯芬酸鈉組灌胃劑量每隻2 mL，即每隻2.08 mg・d-1;空白對照組及模型對照組予以等體積的生理鹽水灌胃。各組大鼠連續灌胃3 d及造模前1 h進行灌胃，每日1次。最後一次灌胃後1 h，按上述造模方法造模。造模後繼續給藥，每日1次，直至大鼠處死。
2.4 標本取材 將大鼠用質量分數爲20%的烏拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉後，股動脈放血約4～6 mL，靜置約1 h後，以2500 r・min-1速度離心30 min，分離血清，用於ELISA檢測。大鼠放血後，將其處死，進行常規消毒，沿後肢右膝關節正中縱行剪開皮膚，暴露出膝關節，打開膝關節腔，用眼科剪取完整的關節滑膜組織，用PBS水清洗去除血跡後，置於1.5 mL預冷的離心管中，然後加用質量分數爲4%的多聚甲醛約1 mL固定，迅速凍存在-80 ℃冰箱中。