【摘要】 目的建立兔含藥血漿中黃芪甲苷含量快速測定的新方法。方法固相萃取法富集血漿中的黃芪甲苷;Agilent SB-C18反相色譜進行分離;採用離子阱質譜多級反應模式，以m/z 807.5→627.1爲選擇離子對，內標法測定含量。結果血漿中黃芪甲苷的檢測限爲0.1ng/mL，線性範圍爲0.5～50.0μg/mL，平均方法回收率在96.3%～104.7%範圍內。結論該方法具有靈敏度高、穩定性好和快速的特點，符合生物樣品的分析要求，有望用於黃芪甲苷的藥代動力學研究。
【關鍵詞】 黃芪;黃芪甲苷;固相萃取;HPLC-MS/MS
ABSTRACT: ObjectiveTo establish a new method for the determination of astragaloside Ⅳ in rabbit plasma by high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry (HPLC-MS/MS)odsAstragaloside Ⅳ in plasma samples was enriched by solid phase extraction. The resulted samples were further separated by reverse phase chromatography with Agilent SB-C18 column. Multiple reaction mode of MS/MS was employed to determine the concentration of astragaloside Ⅳ by internal standard with m/z 807.5→627.1 as the selected ion ltsThe detection limit of astragaloside Ⅳ in plasma samples was 0.1ng/mL, the linear range was 0.5-50.0μg/mL, and the average recovery rate of the method was within the range of 96.3%-104.7%. ConclusionThe proposed method has the characteristics of high sensitivity, good stability and high speed. These properties can meet the requirements of the analytical method for biological samples, which indicates that the method may be used in pharmacokinetic study of astragaloside ⅣORDS: Radix Astragali; astragaloside Ⅳ; solid phase extraction; high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry (HPLC-MS/MS)
黃芪爲中醫臨牀廣泛應用的益氣中藥之一，味甘、性溫，具有補氣固表、脫毒和利尿等功效。中華人民共和國規定臨牀所用黃芪藥材爲豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的乾燥根[1]。黃芪甲苷爲黃芪的主要有效成分之一，其含量測定方法主要包括薄層掃描法[2]和以紫外[3]和蒸發光散射[4]爲檢測方法的高效液相色譜法。由於黃芪甲苷爲紫外末端吸收物質，上述方法雖能用於黃芪藥材及製劑中黃芪甲苷的含量測定，但靈敏度方面難以滿足生物樣品中黃芪甲苷的測定要求。本文采用固相萃取法對兔含藥血漿中的黃芪甲苷進行富集，高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS/MS)進行分離測定，旨在建立可用於黃芪甲苷藥代動力學及在其他生物樣品中含量測定的新方法。
1材料與方法
1.1藥品與試劑黃芪甲苷對照品(中國藥品生物製品檢定所)，地高辛對照品(中國藥品生物製品檢定所)。黃芪藥材購自陝西省中藥材公司，經陝西省藥品檢驗所鑑定爲蒙古黃芪。乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，水爲超純水(自制)，其他試劑均爲分析純。
1.2儀器Agilent 1100系列液相色譜-離子阱質譜聯用系統(含二元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、離子阱質量分析器及Agilent Chemstation 5.2控制軟件包)。Alltech公司固相萃取儀;Agilent C18固相萃取柱(500mg，6cc，美國安捷倫公司)。
1.3實驗動物新西蘭大白兔，♀、♂各半，體重1.8～2.3kg，由西安交通大學實驗動物中心提供，動物合格證號：陝醫動字第082018號。
1.4固相萃取柱的活化方法取安捷倫公司C18(500mg，6cc)固相萃取小柱安裝於固相萃取儀上，依次用10mL甲醇、20mL超純水、10mL 600mL/L甲醇溶液洗脫活化。
1.5供試品溶液的製備
1.5.1黃芪甲苷對照品溶液的製備精密稱取黃芪甲苷對照品5.0mg，置10.0mL量瓶中，用甲醇溶解並定容稀釋至刻度，製備成濃度爲0.5mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液。
1.5.2地高辛對照品溶液的製備精密稱取地高辛對照品3.0mg，置5.0mL量瓶中，用甲醇溶解並定容稀釋至刻度，製備成濃度爲0.6mg/mL的地高辛儲備液。
1.5.3黃芪藥材的提取稱取黃芪藥材20.0g，乾燥至恆重，粉碎，過40目篩，準確稱取藥材粉末100.0g，加10倍量甲醇，冷浸過夜，超聲提取3次，每次30min，濾過，合併濾液，減壓濃縮後製成幹膏，研磨成粉，以羧甲基纖維素鈉懸浮，備用。
1.5.4空白血漿樣品溶液的製備取兔混合空白血漿0.5mL，加入地高辛對照品溶液10μL，置於2.0mL離心試管中，加入20μL濃度爲10.0mol/L的三氯乙酸溶液，5000r/min離心5min，取上清液通過已活化好的固相萃取小柱，先用3.0mL水洗脫，再用2.0mL甲醇洗脫。收集甲醇洗脫液，40℃氮氣吹乾，殘渣用流動相溶解，0.45μm有機濾膜過濾，冷藏備用。
1.5.5含藥血漿樣品的製備新西蘭大白兔3只，12h禁食不禁水，以黃芪甲苷劑量爲2.0mg/kg(相當於每公斤4.0g藥材)灌胃給予黃芪藥材提取液。分別於給藥後0、10、30和60min耳緣靜脈取血1.5mL，肝素抗凝，離心製備血漿。取血漿0.5mL，加入地高辛對照品溶液10.0μL，置於2.0mL離心試管中，加入20.0μL濃度爲10.0mol/L的三氯乙酸溶液，5000r/min離心5min，取上清液通過已活化好的固相萃取小柱，先用3.0mL水洗脫，再用2.0mL甲醇洗脫。收集甲醇洗脫液，40℃氮氣吹乾，殘渣用流動相溶解，0.45μm有機濾膜過濾，冷藏備用。
1.6分析條件色譜柱爲Agilent SB-C18柱(5μm，4.6mm×150mm);流動相爲甲醇-5.0mmol/L乙酸水(75∶25，V∶V);流速爲0.8mL/min;柱後2∶1分流，三分之一流出液進行質譜檢測。質譜條件爲：電噴霧正離子模式檢測;霧化氣壓力爲40.0psi;乾燥氣溫度爲325℃，流速爲9.0L/min;黃芪甲苷選擇m/z 807.4→627.2爲離子對，地高辛選擇m/z 803.5→m/z 785.1爲離子對;質量掃描範圍爲100～1500amu。
2結果