0 引言
1975 年Kohler 和Milstein 首先報道，用細胞雜交技術，使經綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細胞，與小鼠的骨髓瘤細胞融合，並由此創建了第一個B 細胞雜交瘤細胞株，獲得了抗SRBC 的單克隆抗體。他們首先創立了將能分泌特異性抗體的B 淋巴細胞同無限繁殖的骨髓瘤細胞融合技術，爲單克隆抗體的製備奠定了基礎。這是免疫學，乃至醫學史上的一個里程碑。
單克隆抗體以特異性高、性質均一和針對特定靶點定向製備等諸多優點而廣泛應用於各種疾病的治療，特別是在腫瘤領域內的應用備受關注。美國FDA 先後批准了10 多個用於治療腫瘤的抗體藥物，都是全長抗體。雖然單克隆抗體在腫瘤治療中發揮了重要的作用，但全長單克隆抗體治療腫瘤成本太高：治療腫瘤的抗體需要量極多且純度要求高，目前的生物製藥工藝難以滿足市場的需求，大規模、高密度的哺乳動物細胞培養技術是目前國際上的一大難題，這些均導致高生產成本及昂貴的價格，一般患者難以承受。
因此，本課題的目的是利用非增殖腺病毒作爲載體攜帶全長抗體基因在體內表達全長抗體，這樣可以避免在體外用哺乳動物細胞表達抗體，以及純化等複雜而且昂貴的規程。AT2是一個對腫瘤有明顯療效的抗EGFR 單克隆抗體Cetuximab。由於EGFR 在很多腫瘤中都有過量表達，在腫瘤的發生、生長、抗藥性和轉移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 對過量表達EGFR 的腫瘤有良好的治療作用，現已被批准用於頭頸癌、直腸癌和肺癌的治療，無論是單獨使用還是與其它藥物聯合應用都有很好的效果，只有很小的副作用，出現嚴重反應的概率不及萬分之一。Cetuximab 單抗應用其它腫瘤治療的研究也在大力的'開發中，在腫瘤的治療中有很大應用前景，但是由於其生產成本過高，國內普通患者難以承擔，而抗體基因治療正好解決了這個問題。本研究根據人體內密碼子的偏愛性選擇修改了部分氨基酸密碼子，構建了修改密碼子後的重組腺病毒載體。體外實驗表明，通過修改密碼子後提高了抗體的表達量，通過Western 和IFN 實驗檢驗，無論修改密碼子與否，重組腺病毒在293 細胞中表達的抗體與商品化的 Cetuximab 單抗相近的特性，分子量大小一致，與抗原EGFR 有很好的結合，說明我們構建的載體表達的抗體是有活性的。
1. 材料和方法
1.1 材料5 型腺病毒骨架質粒pBHGE3（加拿大Microbix Biosystems 公司），人表皮鱗癌細胞株A431、SK-Br-3 細胞和人胚胎腎細胞293 細胞(購於ATCC)，DMEM 細胞培養液，胎牛血清FBS(購於GIBCO 公司),穿梭載體pDC339 (本實驗室構建)。引物和抗體基因由上海生工公司合成。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養A431 細胞、SK-Br-3 細胞和293 細胞在5%CO2，37℃ 條件下培養，培養液爲含10%FBS的DMEM。
1.2.2 構建攜帶抗體基因重組
腺病毒載體我們首先分別合成修改密碼子前後的AT2 抗體基因的輕鏈及重鏈，且在輕鏈及重鏈前面各自合成抗體的信號肽基因，用IRES 元件連接抗體的輕鏈和重鏈基因，以實現AT2 抗體的重鏈和輕鏈的平衡性及完整性，經PCR 引入酶切位點後，逐步把重輕鏈基因裝入載體pDC339 中。
經過酶切和 PCR 鑑定後測序。PCR 鑑定穿梭載體pDC339-AT2 和pDC339-NAT2(修改過密碼子)重、輕鏈的引物分別是GT340+GT341（輕鏈）、GT342+ GT343（重鏈）和ATNL-1+ ATNL-4（輕鏈）、 ATNH-1 +ATNH-4（重鏈）。測序正確後的穿梭載體與5 型腺病毒骨架質粒pBHGE3 利用轉染試劑Lipofectamine 2000 共轉染至293 細胞，通過同源重組的方法獲得攜帶目的基因的重組病毒。共轉染後9～14 d 出現病毒空斑，經過PCR 法鑑定目的基因正確後，得到表達Cetuximab 抗體的重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2。簡化示意圖如下：
1.2.3 病毒擴增和純化
病毒滴度測定重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 經鑑定正確後進行大擴後，用HPLC 法在純化車間純化，應用50%組織培養感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度。
1.2.4 重組腺病毒表達的抗體檢測